Biosensory DNA do wykrywania mikroorganizmów chorobotwórczych w żywności

Skuteczne zapewnienie bezpieczeństwa żywności wymaga szybkiej i wiarygodnej oceny zagrożeń płynących z zanieczyszczenia jej niepożądaną mikrofiorą chorobotwórczą. W niniejszej książce przedstawiono konwencjonalne oraz alternatywne metody wykrywania bakterii patogennych w produktach spożywczych. W szczególności zaprezentowano możliwości wykorzystania biosensorów DNA do detekcji kwasów nukieinowych specyficznych dla poszukiwanych mikroorganizmów. Omówiono też podstawowe elementy składowe istotne w konstrukcji i funkcjonowaniu elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania chorobotwórczych drobnoustrojów.
W części doświadczalnej książki zaprezentowano wyniki prac nad przygotowaniem elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania drobnoustroju o rosnącej istotności jako mikroorganizmu potencjalnie chorobotwórczego - bakterii Aeromonas hydrophila. Przedstawiono między innymi sposób wykorzystania mieszanych samoorganizujących się monowarstw w warstwie detekcyjnej urządzenia oraz zastosowanie elektroaktywnych wskaźników w ocenie wyników hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Opracowany biosensor został z powodzeniem zastosowany do wykrywania bakterii A. hydrophila w próbkach żywności.

Wstęp

           

Mikroflora chorobotwórcza w żywności, metody wykrywania. Biosensory1. Zagrożenie żywności mikroflorą chorobotwórczą          

1.1. Skala zagrożeń mikrobiologicznych żywności       

1.2. Zatrucia pokarmowe o etiologii bakteryjnej

1.3. Aeromonas hydrophila – charakterystyka zagrożenia         

1.4. Metody wykrywania bakterii chorobotwórczych w żywności         

2. Biosensory  

2.1. Zasada konstrukcji biosensora       

2.2. Obecny stan rozwoju technologii biosensorowych 

3. Wykorzystanie biosensorów DNA w badaniu żywności        

3.1. Biosensory do wykrywania związków chemicznych oddziałujących z dsDNA        

3.2. Biosensory do wykrywania specyficznych fragmentów kwasów nukleinowych      

3.2.1. Badanie żywności zmodyfikowanej genetycznie 

3.2.2. Detekcja mikroflory patogennej

4. Elementy analizy elektrochemicznej w biodetekcji DNA      

4.1. Techniki pomiarowe z kontrolowaną zmianą potencjału     

4.1.1. Chronoamperometria/chronokulometria  

4.1.2. Woltamperometria cykliczna      

4.1.3. Woltamperometria fali prostokątnej       

4.2. Elektrochemiczny układ pomiarowy         

4.2.1. Środowisk pomiarowe   

4.2.2. Elektroda pracująca       

4.2.3. Elektroda odniesienia i pomocnicza       

4.3. Modyfikacje elektrody pracującej 

4.3.1. Samoorganizujące się monowarstwy      

4.3.2. Immobilizacja sond DNA

5. Systemy detekcji hybrydyzacji w elektrochemicznych biosensorach DNA

5.1. Czynniki wp3ywaj1ce na proces  hybrydyzacji DNA         

5.2. Detekcja procesu hybrydyzacji kwasów nukleinowych      

5.2.1. Bezpośrednie metody detekcji hybrydyzacji DNA

5.2.2. Pośrednie metody detekcji hybrydyzacji DNA

 

Konstrukcja elektrochemicznego biosensora DNA i jego zastosowanie do wykrywania bakterii Aeromonas hydrophila. Badania własne

1. Materiały i metody

1.1. Aparatura, sprzęt i oprogramowanie          

1.2. Odczynniki

1.3. Procedury pomiarowe       

1.3.1. Wyznaczanie elektrochemicznego pola powierzchni elektrody    

1.3.2. Badanie elektrochemicznego efektu blokowania 

1.3.3. Pomiar pojemności elektrycznej interfazy elektroda–roztwór elektrolitu

1.3.4. Wyznaczenie ilości DNA unieruchomionego na powierzchni elektrody złotej      

1.3.5. Ocena wyników hybrydyzacji z użyciem błękitu metylenowego  

1.3.6. Ocena wyników hybrydyzacji z użyciem wskaźnika Hoechst 33258

1.4. Pozostałe procedury         

1.4.1. Czyszczenie powierzchni elektrod złotych          

1.4.2. Wybór  i ocena sond ssDNA      

1.4.3. Aktywacja sond ssDNA 

1.4.4. Modyfikacja  powierzchni elektrod pracujących 

1.4.5. Hybrydyzacja w warstwie detekcyjnej biosensora

1.4.6. Izolacja i amplifkacja bakteryjnego DNA

2. Wyniki i dyskusja    

2.1. Zaprojektowanie sond ssDNA specyficznych dla genu aerolizyny A. hydrophila    

2.2. Przygotowanie elektrody pracującej i ustalenie warunków pomiarów         

2.2.1. Przygotowanie powierzchni elektrod złotych      

2.2.2. Charakterystyka buforów wytypowanych do pomiarów elektrochemicznych       

2.2.3. Sygnał elektrochemiczny wybranych wskaźników hybrydyzacji DNA

2.3. Modyfikacja powierzchni elektrody złotej – konstrukcja warstwy detekcyjnej biosensora

2.3.1. Efekt blokowania elektrochemicznego przez monowarstwy SAM

2.3.2. Pojemność elektryczna interfazy między powierzchnią elektrody a roztworem elektrolitu

2.3.3. Gęstość powierzchniowa sond ssDNA w warstwie detekcyjnej biosensora

2.4. Reakcja hybrydyzacji w warstwie detekcyjnej biosensora  

2.4.1. Charakterystyka DNA zakumulowanego na powierzchni elektrody pracującej

2.4.2. Wpływ czasu reakcji na wydajność hybrydyzacji

2.4.3. Odpowiedź systemu detekcji hybrydyzacji na zmianę stężenia docelowego DNA

2.4.4. Odpowiedź systemu detekcji hybrydyzacji na obecność niekomplementarnych fragmentów DNA

2.5. Wykrywanie Aeromonas hydrophila w wodzie pitnej         

2.5.1. Detekcja z użyciem wskaźnika błękitu metylenowego     

2.5.2. Detekcja z użyciem wskaźnika Hoechst 33258   

3. Podsumowanie wyników badań